抗菌肽
抗菌肽又稱抗微生物肽或宿主防御肽,是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有廣譜抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)活性的一類(lèi)小分子多肽,屬于機(jī)體非特異性防御系統(tǒng)的固有組成部分,幾乎存在于所有生命形式中?？咕耐ǔＳ?2-50個(gè)氨基酸組成,相對(duì)分子質(zhì)量一般在2-5 kDa左右。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有快速殺菌和廣譜抗菌活性，包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、多重耐藥細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)、包膜病毒和腫瘤細(xì)胞，并能在先天免疫和獲得性免疫之前起到橋梁作用，通過(guò)啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)提高機(jī)體抵抗微生態(tài)感染的能力。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)超過(guò)3000種抗菌肽。
基于全球無(wú)抗政策的推動(dòng)，抗菌肽無(wú)殘留、無(wú)耐藥性、無(wú)配伍禁忌、無(wú)停藥期，無(wú)毒安全等優(yōu)勢(shì)，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究最熱點(diǎn)之一。目前抗菌肽的生產(chǎn)方式主要有三種：天然提取、化學(xué)合成和生物工程發(fā)酵。天然抗菌肽主要來(lái)自動(dòng)植物，含量極低，提取過(guò)程甚為復(fù)雜;化學(xué)合成方法高昂，每公斤成本上千萬(wàn)人民幣，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，無(wú)法廣泛普及應(yīng)用。生物工程發(fā)酵是利用發(fā)酵技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)，具備質(zhì)量穩(wěn)定、成本低等優(yōu)勢(shì)，是業(yè)界公認(rèn)的規(guī)模化生產(chǎn)的最佳途徑。但商品化抗菌肽開(kāi)發(fā)并非一蹴而就，有以下幾個(gè)難點(diǎn)。
01
抗菌肽的生物學(xué)活性
目前學(xué)術(shù)界對(duì)抗菌肽的抗菌機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要有以下兩種觀點(diǎn)，其一是抗菌肽作用于細(xì)胞膜?？咕奈锢碜饔糜诩?xì)菌的細(xì)胞膜上，使細(xì)胞膜穿孔并溢出細(xì)胞質(zhì)，從而達(dá)到殺死細(xì)菌。抗菌肽具有疏水性和親水性的兩親性質(zhì)，因此抗菌肽帶正電荷的分子和細(xì)胞膜磷脂分子上的負(fù)電荷形成靜電吸附結(jié)合到膜上，然后疏水端將分子插入膜中，從而使整個(gè)分子被吸入質(zhì)膜，這就破壞了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在質(zhì)膜上的原始排列，形成跨膜離子通道，大量離子丟失，細(xì)菌無(wú)法維持所需的胞內(nèi)滲透壓而死亡。抗菌肽殺菌第二種觀點(diǎn)是與細(xì)菌胞內(nèi)的靶點(diǎn)結(jié)合，從而達(dá)到抑制或殺滅細(xì)菌的作用。抗菌肽可以直接作用細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的生物合成過(guò)程，例如抑制DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)胞壁的合成，改變細(xì)胞質(zhì)膜通透性，抑制合成酶的活性和激活菌體自溶等，如腸桿菌肽抑制細(xì)菌的RNA聚合酶。也有一些抗菌肽可以通過(guò)影響多個(gè)生物合成過(guò)程來(lái)起到多渠道殺滅細(xì)菌。
在篩選抗菌肽的前期研發(fā)，首先需要研究抗菌譜，即抗菌作用的面是否廣泛，是否和現(xiàn)有臨床疾病相對(duì)應(yīng)，其次還需要研究抗菌強(qiáng)度，一般用最小抑菌濃度(MIC)來(lái)表示，例如一個(gè)抗菌肽對(duì)某一個(gè)病原菌有抗菌活性，但MIC值太高，即需要使用超大劑量才能達(dá)到有效性，這樣的產(chǎn)品也是沒(méi)有價(jià)值的。如腸桿菌肽對(duì)大腸桿菌的MIC<0.5ug/mL，對(duì)沙門(mén)氏菌MIC<0.1ug/mL，抗菌效果好的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)才會(huì)有市場(chǎng)價(jià)值。
02
抗菌肽的穩(wěn)定性
抗菌肽產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的另一個(gè)問(wèn)題就是大部分抗菌肽穩(wěn)定還不夠理想，因?yàn)榭咕淖鳛槎嚯念?lèi)物質(zhì)，耐高溫、耐酸堿性能不是特別強(qiáng)。
抗菌肽屬于生物活性多肽，在生物發(fā)酵過(guò)程中宿主菌大都會(huì)產(chǎn)生很多蛋白酶，這些蛋白酶對(duì)多肽有降解的活性，這樣就會(huì)造成生產(chǎn)出來(lái)的抗菌肽在發(fā)酵過(guò)程中就被降解損耗掉，失去生產(chǎn)價(jià)值。在生產(chǎn)過(guò)程中，抗菌肽物料還需要由液體經(jīng)過(guò)加工變?yōu)楣腆w，這些過(guò)程都需要熱源，如果一個(gè)抗菌肽不耐熱，一樣失去生產(chǎn)價(jià)值。
同時(shí)我們開(kāi)發(fā)抗菌肽的作用最重要的一個(gè)使用途徑是經(jīng)口給藥，抗菌肽有可能被消化道內(nèi)的胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽汁酸等物質(zhì)會(huì)降解，導(dǎo)致無(wú)法發(fā)揮其生物學(xué)活性。對(duì)于口服給藥的多肽類(lèi)產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，難度是非常大的。
多肽物質(zhì)，結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)。如腸桿菌肽為鎖套肽，其中N端的8個(gè)氨基酸形成一個(gè)圓形的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，9-21個(gè)氨基酸形成尾巴，貫穿圓環(huán)，故其性質(zhì)超級(jí)穩(wěn)定，對(duì)高溫、酸、堿、胃蛋白酶、胰蛋白酶有良好的抵抗力?？莶菥挠袃蓚€(gè)二硫鍵，這些空間結(jié)構(gòu)決定了性質(zhì)的穩(wěn)定性。當(dāng)然有些抗菌肽本身不穩(wěn)定，科研工作者為了解決這個(gè)問(wèn)題，提出很多方案以防止抗菌肽在體內(nèi)被降解，如：分別對(duì)肽鏈的氨基端和羧基端進(jìn)行乙?；王０坊揎棥⒕€性肽鏈進(jìn)行首尾環(huán)化處理以提高穩(wěn)定性、形成聚乙二醇肽增強(qiáng)抗水解酶能力、脂質(zhì)體包裹抗菌肽使其緩慢釋放等方案。這些方案一定程度上緩解了抗菌肽的降低，但是帶來(lái)的副作用就是產(chǎn)量降低，影響活性、工藝更加復(fù)雜，大大提高了抗菌肽的生產(chǎn)成本。
03
抗菌肽的生產(chǎn)效率
抗菌肽具有廣闊的應(yīng)用前景，但是在制藥、食品、畜牧業(yè)等行業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用的主要問(wèn)題就是生產(chǎn)成本太高。抗菌肽大規(guī)模生產(chǎn)的主要限制條件之一就是成本問(wèn)題，因此生產(chǎn)效率的高低直接決定是否可以大規(guī)模應(yīng)用，特別是在農(nóng)牧等對(duì)成本要求苛刻的領(lǐng)域。
前文分析，天然提取和化學(xué)合成都不適合抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化，生物工程發(fā)酵時(shí)唯一可行方法，但也有很多難點(diǎn)。目前文獻(xiàn)報(bào)道的抗菌肽生產(chǎn)水平只有1-150mg /L ，如Chen等學(xué)者利用SUMo融合表達(dá)技術(shù)在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了抗菌肽 Cecropin AD，搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)量為30.6mg/L；Bi等在大腸桿菌BL21中成功融合表達(dá)了雜合肽LfcinB-Melittin，通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵液的含量為35mg/L;另有學(xué)者Cao使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了雞的防御素Avian β-defensin6，發(fā)酵液中含量達(dá)到了114.9mg/L。我國(guó)科研人員在抗菌肽生產(chǎn)水平上實(shí)現(xiàn)了巨大突破，據(jù)報(bào)道農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼用抗生素替代技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)研究的抗菌肽發(fā)酵水平是文獻(xiàn)報(bào)道的100倍左右。
04
抗菌肽的純化工藝
抗菌肽純品的獲取很難?？咕牡?strong style="margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">分離純化是獲取過(guò)程中的一項(xiàng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不管是天然的抗菌肽，還是基因工程技術(shù)獲得的抗菌肽，抗菌肽在分離純化基質(zhì)中的占比都很小，存在大量的雜蛋白及其他物質(zhì)，對(duì)于成分未知或者結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗菌肽就難度更大。所以，分離純化抗菌肽的關(guān)鍵在于不僅要得到單一的多肽，而且要保證獲取多肽的生物學(xué)活性，這是進(jìn)行下一步科學(xué)研究的基礎(chǔ)?？咕氖且活?lèi)小分子多肽，不同多肽的氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其在物理、化學(xué)、生物學(xué)等性質(zhì)上存在差異，利用待分離多肽與其它蛋白質(zhì)性質(zhì)上的差異，即可以設(shè)計(jì)出一套合理的多肽純化方案。在發(fā)酵液中，抗菌肽的占比不到1%，如果去掉99%的雜質(zhì)，獲得純度大于99.6%的抗菌肽單體是一項(xiàng)艱巨的科研工程。
05
建立抗菌肽檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
關(guān)于抗菌肽的評(píng)價(jià)方法有兩大類(lèi)，一類(lèi)是檢測(cè)抗菌肽的抗菌活性；主要使用擴(kuò)散法測(cè)定。原理是不同濃度的抗菌肽與作用于培養(yǎng)基中的菌種，抗菌肽殺死細(xì)菌從而會(huì)形成大小不同的抑菌圈，根據(jù)圈的大小，就可判定出抗菌肽的抗菌活性。同樣，一般在0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙褐屑尤氩煌瑵舛鹊目咕?，抗菌肽?huì)不同程度的影響菌懸液的生長(zhǎng)，根據(jù)吸光度的高低，可以判斷抗菌活性的強(qiáng)弱?？咕钚詸z測(cè)方法最大的問(wèn)題是無(wú)法區(qū)分微生物發(fā)酵液中其他組分對(duì)抑菌結(jié)果的影響，如發(fā)酵液的培養(yǎng)基、pH等都會(huì)有一定的抑菌活性。更有甚者，在產(chǎn)品中加入其它抑菌物質(zhì)冒充抗菌肽。這種抗菌活性檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，人員設(shè)備要求低，是目前大多數(shù)抗菌肽研究所采用的方法，但不能確定產(chǎn)品中是否真實(shí)含有抗菌肽，只能表明該產(chǎn)品由抑菌活性。在抗菌肽的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立過(guò)程中，該方法只能作為輔助使用。
另一類(lèi)是定性定量檢測(cè)方法，一般用的是高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳。毛細(xì)管電泳設(shè)備投資大，一般研究單位使用較少。HPLC對(duì)混合物中復(fù)雜組分的分離能力強(qiáng)，也可以與其他技術(shù)聯(lián)合使用對(duì)物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量分析。不同理化性質(zhì)的抗菌肽可以用不同分離原理的色譜進(jìn)行分離，如極性大的抗菌肽可以用親水色譜進(jìn)行分離，不同電荷的抗菌肽可以用離子交換色譜分離，但科研工作中最常用的還是反向高效液相色譜法，也是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的多肽類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)最科學(xué)的方法。如李波研究了高效分泌天蠶素的枯草芽孢桿菌宿主菌的中試發(fā)酵工藝，用反向高效液相色譜法檢測(cè)天蠶素含量達(dá)到961.52μg/m L。
06 研發(fā)投入成本高 抗菌肽屬于多肽類(lèi)生物藥，一種新藥從最初發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物到最終上市，需要經(jīng)歷漫長(zhǎng)過(guò)程。前瞻產(chǎn)業(yè)研究院報(bào)告顯示，國(guó)際上一種新藥的成本已經(jīng)超過(guò)10億美元，研發(fā)周期超過(guò)10年。但與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)創(chuàng)新藥物研發(fā)仍處于劣勢(shì)，無(wú)論是研發(fā)投入能力還是產(chǎn)出方面與發(fā)達(dá)國(guó)家均有一定差距。新藥研發(fā)資金需求高、投入時(shí)間長(zhǎng)，需要政策與資本的雙重支持。
綜上所述，抗菌肽產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)困難重重，需要廣大科研工作者攻堅(jiān)克難。隨著抗菌肽研究的不斷深入以及生物技術(shù)的發(fā)展，希望未來(lái)有更多、更好的抗菌肽產(chǎn)品能夠產(chǎn)業(yè)化，從而能夠促進(jìn)整個(gè)醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。
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